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摘要：研究小组使用相对的照明光和通用检测系统，开发了一种同时定量前向散射光和后向散射光的显微镜，将可以检测到的散射信号的强度范围宽了约14倍，从而同时实现了对细胞内大型结构和微粒的动态变化的可视化。

关键词：双向定量散射显微镜、前/后向散射光、细胞内部、可视化、定量

要点

研究小组开发了一种“双向定量散射显微镜”，通过一个检测系统即可同时量化对细胞的大型结构敏感的“前向散射光”、以及对纳米级微粒敏感的“后向散射光”。
与仅测量前向散射光的传统方法相比，研究小组成功实现了大约14倍宽的信号检测范围，并同时可视化了细胞内大型结构和微粒的动态变化。研究还证实，通过比较前向和后向散射光的强度，可以定量确定微粒的折射率和粒径。
研究表明，通过对快速获取的视频进行频率分析，能够定量细胞死亡过程中细胞内结构和微粒运动的活性度。未来，有望用作一种新的测量方法来检测细胞内流动性。

双向定量散射显微镜的概念图

概要

研究小组开发出一种可同时定量前向和后向散射光的“双向定量散射显微镜”。相比仅能检测前向散射的传统方法，这种显微镜可以检测到的散射信号的强度范围宽了约14倍，从而能够在从细胞内的大型结构到约100纳米的微粒的广泛尺度上实现可视化。此外，通过分析前后散射强度的差异，研究小组证实了可以定量细胞内微粒的折射率和粒径。研究小组还观察到细胞死亡过程中，细胞内结构和微粒运动的活性随时间变化的情况。这一成果为阐明细胞内结构与微粒动态之间的关系提供了新的线索，并扩展了定量相位显微镜和干涉散射显微镜等现有无标记显微镜的应用范围。

研究内容

广泛应用于无标记显微镜的定量相位显微镜（Quantitative Phase Microscopy,QPM）是一种通过测量由样品折射率分布引起的前向散射光，从而可视化细胞结构（例如干物质分布和细胞器）的方法。然而，由于光的量子涨落（光量子噪声），其灵敏度存在局限，导致难以检测高速运动的微粒。另一方面，虽然干涉散射显微镜（Interferometric Scattering Microscopy,iSCAT）能够利用后向散射光高灵敏度地捕捉微粒，但难以全面测量整个细胞的结构。如果能够同时测量这两者，将能够一次性捕捉到大结构和小粒子的动态，从而有助于深入理解细胞的多层次动态过程（图1a）。

本研究中，研究小组使用相对的照明光和通用检测系统，开发了一种同时定量前向散射光和后向散射光的显微镜（图1b）。通过基于离轴数字全息技术的空间频率复用方法，研究小组成功从一张图像中分离出前向散射光和后向散射光，并对其分别进行了定量成像（图1c）。

图1：双向定量散射显微镜的原理

a）散射体大小与前向散射光和后向散射光强度的关系以及它们各自的可检测范围；

b）双向定量散射显微镜的光学系统示意图；

c）从一张测量图像中重构前向散射光和后向散射光图像的空间频率复用的分析示例。通过对频率空间中分离的成分进行单独分析，可以计算出前向散射光和后向散射光的定量图像。

在观察活细胞时，前向散射图像清晰地显示了细胞器等大型结构，而后向散射图像则能够捕捉到了前向散射无法检测到的微粒信息（图2a）。通过同时捕捉双向散射光，检测信号范围比仅测量前向散射光扩大了约14倍。此外，通过分析前向和后向散射强度的差异，研究小组成功定量了被认为是微小脂质滴的约100nm的细胞内微粒的折射率和粒径。除了观察静止图像（快照）外，该方法还具有可视化细胞内结构和颗粒随时间变化（波动）的优势（图2b）。利用这一特性，研究小组定量测量了细胞死亡过程中颗粒运动活性随时间变化的情况。

图2：利用双向定量散射显微镜进行的细胞测量

a）上图：前向散射振幅图像和后向散射振幅图像（静止图像）；下图：上图中绿色方框所示的区域内细胞内微粒的放大图像；

b）通过分析散射振幅图像的时间变化计算得到的细胞内特定频段（1–10Hz）内的波动图。

术语解释

注1）干质量分布：表示去除细胞内水分后的成分（蛋白质、脂质等）的质量的空间分布。是研究细胞生长和代谢状态的指标。
注2）光量子噪声：当将光视为粒子（光子）时，由于统计波动不可避免地产生的测量噪声。这是决定灵敏度极限的因素之一。
注3）离轴数字全息技术：一种使参考光与样品的散射光发生干涉，使用图像传感器记录其干涉图案的方法。通过计算处理所获得的数据，可视化样品内部由折射率分布引起的光的相位延迟。
注4）空间频率复用技术：一种在一张测量图像上叠加记录多个干涉图案，并通过傅里叶变换在频率空间中将它们分离的技术。通过这种方式，可以同时获取具有不同信息的成分，并通过计算重构。

https://www.s.u-tokyo.ac.jp/ja/press/10974/

https://www.nature.com/articles/s41467-025-65570-w

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一种能够同时观察细胞内结构和微粒运动的显微镜