摘要：生物燃料电池（Biological fuel cells，简称biofuel cells）是一种生物电化学装置，利用生物催化剂（包括氧化还原酶、细胞器和含氧化还原酶的微生物）从化学能中产生电能。本文在理解氧化还原酶固有物理化学性质的基础上，介绍了生物燃料电池的特征。还详细介绍了生物阴极和生物阳极构建的基本概念和策略，并介绍了一些生物燃料电池的实例。此外，对生物燃料电池研究和生物电化学能量交换系统研究中需要克服的问题和前景进行了广泛的讨论。

关键字：氧化还原酶，重组能，取向，介孔电极，微孔结构，介体，线性自由能关系，微生物，超电势，可逆催化

1、前言

生物燃料电池（生物电池，biofuel cells）是使用在温和条件下能有效发挥作用的酶和微生物等作为电极催化剂的能量转换装置，具有使用氧化还原酶或微生物等生物催化剂代替贵金属催化剂的温和燃料电池的特点。其可以使用糖、酒精、有机酸、氢等各种身边熟悉的能源作为燃料，因此作为安全且廉价的新一代电源备受关注，并且实用性研究也在迅速发展。本文介绍了其工作原理和特征，并对最近的研究开发动向和未来的发展前景进行了概述。

2

历史与特征

氧化还原酶的种类很多，约占全酶种类的1/4。氧化还原反应遍及生物的所有能量获取系统，与此相关的酶群担任着生物能量转换系统的主角。该转换系统主要由光合作用和代谢•呼吸组成，通过6CO₂/葡萄糖（C₆H₁₂O₆）和O₂/2H₂O之间的氧化还原反应，将光能转换为ATP（三磷酸腺苷），后者用于生命活动（图1）。光合作用相当于充电过程，代谢·呼吸相当于放电过程。由于光合作用和代谢•呼吸这两个过程的氧化还原反应的活化能很高，因此可以使用氧化还原酶系统，将光能储存在糖类中，且在必要的时候摄取•代谢并转换成生物能。

图1 生物能源转化系统概念图

由于这种生物能源转换系统与电池系统具有许多相似之处，因此自然而然地产生了从生物系统中学习并使用该机制创造能源转换装置的想法，而基于这个概念的装置就是生物电池（图2）¹^、²^）。大约100年前，人们曾尝试基于类似概念，利用微生物的力量产生电能³^）。在宇宙开发备受关注的20世纪60年代到70年代，日美都开始了微生物电池的研究。当时主要着眼于以微生物的代谢物作为燃料。另一方面，在同一时期，还使用氧化还原酶作为电极催化剂来构建从有机物到负极的电子转移系统，从而开始酶生物电池的研究⁴^）。当时，对氧化还原酶反应和电极反应之间的共轭的了解尚不充分，电池输出功率也很小。1994年，甲醇/O₂型酶生物电池被开发出来⁵^）。以此为契机，重新掀起了对酶生物电池的研究热潮。进入21世纪，其功率有了飞跃性的提高。受此影响，使用微生物作为电极催化剂的生物电池也被重新研究，从微生物到电极的电子转移系统也受到关注，并且开启了微生物型生物电池的新研究。

图2 生物电池示意图

与稀有金属等相比，氧化还原酶的特点及优点如下：①显示出极高的催化活性；②电子移动的再取向能小，许多酶具有双向催化活性；③对氧化还原的两种基质之一具有高反应特异性；④由于通过生物复制获得，因而具有极高的同—性和均一性；⑤在化学反应方面显示出多样性；⑥可以明确定义辅因子的氧化还原电势，同时理论上可以测量该电势，因此易于精确分析电流-电压曲线。但是另一方面，其也具有以下缺点：⑦尺寸很大，并且由于电极活性氧化还原中心不在酶的正中间，因此酶的取向效应明显；⑧易失活，较脆弱。由于氧化还原酶的这些特性，生物电池具有以下特性：（a）由于使用生物催化剂用作温和催化剂，因此其可以在室温、常压、近中性的条件下发挥催化作用（但是，同时也意味着其只能在这种条件下运行，因此，电流密度（jmax）最大100mA cm^-2左右已是极限⁶^））；（b）过电压非常小，可以获得非常接近理论值的开路电压（OCV）；（c）除了可以利用各种能源外，通过将酶反应系统级联排列，可以构建完整的生物燃料氧化系统⁷^），因此其具有碳中和特性；（d）酶具有可以通过构建大量表达系统从而准确且廉价地生产，易于操作且安全等特征。

3、生物催化反应与电极反应的共轭

利用上述特性③，可以用电极或低分子氧化还原物质直接替换其中一个基质，结果如图3所示，可以使电极酶与电极反应共轭（图3）。直接进行电子授受的情况称为直接电子转移（DET）型酶催化电极反应（图3上），可以通过某些氧化还原酶实现。尽管氧化还原酶具有上述特性①，但由于其尺寸大，难以增加表面酶浓度，因此理论上平面电极的最大电流密度为0.1～1mA cm^-2左右。然而，通过使用多孔电极，可以将电解电流密度提高至数十mA cm^-2。应当强调的是，在DET型反应中使用多孔电极的意义不仅在于增加有效表面积，还在于其具有大幅增加界面电子转移速度的效果⁸^、⁹^）。DET型酶催化电极反应的界面电子转移是长距离型，并且速度常数随距离呈指数下降，由于上述特性⑦，取向效应主要出现在平面电极的电流-电压曲线上。然而，如果酶被吸附在与酶尺寸相近的介孔中，则随机取向的酶的电极活性部位和电极之间的距离变为最小的概率增加（介孔的曲率效应），取向效应减弱，平均反应速度常数大幅增大。此外，同样重要的是，在小于酶尺寸的微孔前端，由于双电层的扩散，可极大地增强电场，其结果是，电子转移速度显著提高（微孔前端的电子转移促进效果）。与多孔效应不同，对于取向性问题，人们设计出各种各样的方法，例如，使氧化还原酶的电极活性部位附近和电极间产生静电相互作用；或者将使电极活性部位附近产生部位特异性变异的酶的变异部位与电极表面官能基共键合，控制酶的取向等。结果造成在DET型反应中，必须制备与每种酶相适应的定制型电极。这样的定制电极不仅可以实现高速界面电子转移，而且由于上述特性②，可以将过电压控制到最小。

图3 酶催化电极（负极）反应的概念图

另一方面，将被称为介体的氧化还原物质（M_ox/M_red）用作酶-电极之间的电子转移介质的情况称为介体电子转移（MET）型反应（图3下）。该反应模式不仅适用于大多数氧化还原酶系统，而且还易于利用多孔电极和毛毡电极（相对于投影面积）增加的有效电极表面积。酶层也可以层压化。因此，有望实现比DET型反应高几倍甚至几十倍的电流密度，且没有必要特别使用适合该酶的定制电极。然而，层压时，必须保证不增加基质和生成物的物质转移阻力。除此之外，还应注意，对于介体的选择和修改方法，需要高度的跨学科知识和技术。首先，由于酶-介体之间的电子转移是非特异性的，因此可以看到自由能的线性关系¹⁰^）。由于低分子介体的重新取向能通常较大，因此酶-介体之间的电子转移需要热力学驱动力。这会导致过电压的增加。换言之，需要权衡过电压的增加和电流密度的指数增加。此外，自由能之间的线性关系可能存在偏差，这主要是由于酶的活性中心附近和介体之间的静电相互作用。选择介体时，必须全面考虑上述因素。此外，介体和酶需要连接至水凝胶等聚合物并固定至电极¹¹^）。从微生物到负极的电子转移也有DET型和MET型。在DET型的情况下，从细胞表面上被称为血红素蛋白或纳米线等导体向电极进行电子转移； MET型方面，由微生物自发分泌的黄素或醌作为介质的系统值得关注。无论如何，已经证实，许多微生物相对容易地或自发地成为负极催化剂。遗憾的是，该平板电极的电流密度仅是酶催化系统的1/1000～1/10000左右。然而，由于反应速度小，不容易产生物质转移阻力，因此有利于层压化，且多孔电极中的微生物催化电流密度可以提高到酶催化系统的1/10～1/100左右。利用层压的微生物生物电池通常表示为单位体积多孔电极的电流密度或输出密度。在微生物生物电池中，由于界面电子转移速度常数小，并且伴随有膜渗透反应和介体反应，因此过电压通常较大且输出较小。

4、生物催化正极战略

作为氧还原正极用的酶，最初⁵^）开始就使用多铜氧化酶（MCO）。MCO广泛存在于我们的日常生活中，例如多酚氧化酶（可催化苹果褐变）和漆酶（可固化漆树液）。类型1（T1）在铜位点接收电子，并在类型2-3铜簇上将O₂还原为4电子。与稀有金属催化剂不同，其不会产生O₂的还原中间体。四个氨基酸在T1位点与铜离子配位，形成四面体结构。因此，通常为平面结构的Cu（II）状态变得不稳定，从而其氧化还原电位比常规的铜络合物更高。由于该性质，氧还原在高电位下进行。该四面体结构同时还是减少重新取向能的一个因素，从而实现高速的DET型界面电子转移。然而，由于O₂的溶解浓度较低，因此必须从气相中获取O₂。为了制造适合酶促反应的气体扩散型酶催化正极，有必要使用同时具有适合气体渗透的疏水性和适合酶促反应的亲水性的生物三相界面（图4）¹²^）。静止时的氧还原电流密度达到几十mA cm^-2。

图4 气体扩散型氧还原生物正极的概念图

从成本角度出发，这种使用MCO作为催化剂的正极难以应用于微生物电池。已有许多文献研究了使用铂代替生物催化剂作为微生物电池的正极，但是铂在中性条件下的氧还原催化能力极小，因此使用铂的优点很少。另一方面，还可以考虑使用H₂O₂作为氧化剂的酶生物电池。实际上，由于H₂O₂/2H₂O的氧化还原电位比O₂/2H₂O高，因此OCV非常适合正极使用过氧化物酶的DET型反应的酶生物电解。然而，由于在高浓度H₂O₂下，酵素会失活，因此实际上难以提高电流密度。尽管可以考虑使用硝酸根离子作为氧化剂，但是对硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶的生物电化学利用的研究尚不充分。

5、生物催化负极战略

生物电池的负极反应可以利用生物体内的所有基质的氧化催化反应。大部分氧化还原酶催化作为基质的电子供体的2电子氧化。由于大多数作为电子供体的基质是氢离子（H^-）转移，因此作为氧化还原酶的辅助因子，NAD(P)⁺或黄素或钼蝶呤（MOCO）成为电子受体。然而，由于H^-不能向电极提供电子，因此必须通过黄素或醌将其转换为e^-型电子转移。这些黄素和醌，在游离状态下，有时也被用作MET型的低分子介体，但当其包含在酶中时，可以通过将电子转移至同一酶内的金属辅助因子，从而转换为e^-型电子转移。因此，金属辅助因子经常用于DET型电极活性部位⁹^）。当利用MET型反应时，葡萄糖的2电子氧化系统达到了数十mA cm^-2左右的电流密度，作为静态条件下的酶生物电池，其输出密度（Pmax）达到了10mW cm^-2左右，可与太阳能电池匹敌¹³^）。作为DET型负极的一个例子，仅通过将果糖脱氢酶吸附在适当的碳材料上，就实现了具有数十mA cm^-2的大电流密度的生物电解2电子氧化系统，而且与气体扩散型氧还原正极组合得到的酶生物电池的Pmax，在静止状态下也达到2~3mW cm^{-2 14}^、¹⁵^）。如果将氢或甲酸用作燃料，则可以用单一酶将其完全氧化。催化这些反应（2H⁺/H₂，CO₂/HC00^_）的氢化酶（H₂ase）和MOCO甲酸脱氢酶（MOCO_FDH）可以催化双向的相互转换反应。因此，可以构建具有极小过电压的催化剂系统。实际上，在我们的小组中，DET型双侧气体扩散H₂/O₂生物电池在40°C、1 atm H₂、1 atm O₂、静止的条件下，达到OCV＝1.14V、Pmax=8.4mW cm^-2；此外，在25°C、1 atm H₂、1 atm air、静止的条件下，达到OCV=1.12V、Pmax=6.1mW cm^{-2 16}^、¹⁷^）。MET型单侧气体扩散HCOO^-/O₂生物电池在25°C、1 atm air、静止的条件下，达到OCV=0.78V、Pmax=12mW cm^{-2 18}^）。然而，若要构建糖和醇转化至CO₂的完整氧化系统，有必要将多种酶促反应级联⁷^）。由于酵素的上述特性②，如果反应的驱动力过大，则将进入反转区域，反应速度反而会下降。实际上，生物体中，驱动力小的反应级联。级联反应系统的构建在科学上是有趣的尝试，并且正在引起全世界的关注。然而，若一系列酶系统中的某一种酶活性降低，会导致级联功能丧失，且每种酶的表面浓度低于单一酶系统。此外，如果在开放系统中进行级联反应，则前一反应的产物因三维扩散而浓度降低，从而导致后续反应速度变得极慢。为了解决这个问题，有必要将所有反应系统限制在诸如细胞之类的超小空间中。如上所述，其在实现过程中仍存在相当大的问题。由于微生物原本就具有级联型多阶段氧化能力，因此微生物生物电池原则上是完整的氧化系统。若允许微生物电池的输出在原理上非常小，并用电极面积或体积来弥补其不足，则可以进行实际讨论。而且，微生物不仅具有可自我再生的优点，还具有无需分离酶的优点。此外，通常只需将电极与微生物接触，就可以随时间自发形成电化学交流。然而，未来有必要明确从微生物到负极的电子转移过程的详细机制，以提高其速度。

6、未来展望

在过去的二十年中，酶生物电池的性能有了飞跃性的提高，现在已经可以与传统电池匹敌。目前为止的有关酶生物电池的各种探索和电池特性，请参阅总论¹⁹⁾。生物电池反映了氧化还原酶的特性，因此一直被研究和尝试；MET型和DET型、燃料种类、完全燃烧系统和不完全燃烧系统、天然酶和变异酶等。相反也可以说，正因如此，在关注和改进哪一种类型上缺乏统一性。另一方面，最大的问题与上述⑧相关。酶的固定化增加了稳定性，但降低了活性；可动性和和活性之间呈线性关系，且需要在可动性和稳定性之间进行权衡。遗憾的是，仍然没有从理论上理解酶稳定性现象并提出解决方案的研究。因此，在现状下，不得不承认至少在酶生物电池的稳定性方面存在局限。出于这种情况，从现实实现的角度出发的开发并没有太大的进展。然而，将生物电池的独有特性以某种形式加以利用的尝试十分重要，未来也应持续下去。目前处于探索中的有玩具电池、可穿戴电池、体内植入型电池、环保电池、一次性·可替换电池、应急电池等。生物电池的开发研究需要从电化学、酶化学、材料化学等各方面开展跨学科研究，因此急需不同领域的研究人员共同参与。一旦用途确定，研究也有望得到迅速发展。

图5 生物电化学氢·C1社会构想的概念图

另一方面，在氢社会中，可以认为图1中的CO₂/C₆H₁₂O₆被2H⁺/H₂置换，电位差也几乎相同。在氢社会运行过程中，就能量损失而言，必须使2H⁺/H₂系统和O₂/2H₂O系统的氧化还原反应的过电压最小。如上所述，在生物电化学系统中，2H⁺≒H₂和O₂→2H₂O反应的过电压接近于零。如果2H₂O→O₂系统也是以MET型来驱动光合作用系统Ⅱ（PSⅡ）的话，则过电压可以降低到0.3V左右，从而构建理想的氢社会。此外，如果使用MOCO_FDH，则可以进一步组合过电压几乎为零的CO₂/HCOO^-反应系统（图5）^20）。H₂ase和MOCO_FDH也与NAD（P）（H）系统连接。换言之，其可以与生物氧化还原反应中重要的H⁺型电子转移系统连接。并且，与H₂ase和MOCO_FDH一样，铁氧化还原蛋白NADP⁺还原酶（FNR）也可以实现NAD（P）（H）的DET型可逆电极反应。由此，生物电化学系统不仅局限于生物电池这个概念，还有望实现可应用于人工光合作用和生物关联物质生产（还原反应的情况下，可以是立体特异性电解）的系统。未来的发展值得期待。

参考文献：

1) X. Xiao, H.-Q. Xia, R. Wu, L. Bai, L. Yan, E. Magner, S. Cosnier, E. Lojou, Z. Zhu, A. Liu, Chem. Rev., 119, 9509 (2019) [Review]

2) 加纳健司（主编），《生物电池的最新动向》，CMC出版社（2011)

3) M. C. Potter, Proc. Roy. Soc. London, Ser. B. 84,260 (1911)

4) A.T. Yahiro, S. M. Lee, D.O. Kimble, Biochim. Biophys. Acta, Spec. Sect. Biophys. Sub., 88, 375 (1964)

5) G. T. R. Palmore, G. M. Whitesides, ACS Symp. Ser., 566, 271(1994)

6) S. Tsujimura, K. Murata, W. Akatsuka, J. Am. Chem. Soc., 136,14432 (2014)

7) D.P. Hickey, E. M. Gaffney, S.D. Minteer, Top. Curr. Chem., 376, #43 (2018) [Review]

8) Y. Kitazumi, 0. Shirai, K. Kano, ACS Symp. Ser., 1342,147 (2020) [Review]

9) T. Adachi, Y. Kitazumi, 0. Shirai, K. Kano, Catalysis, 10, 236 (2020) [Review]

10) K. Kano, Electrochemistry, 87, 301(2019) [Review]

11) Y. Sugimoto, K. So, H.-Q. Xia, K. Kano, “Encyclopedia of Interfacial Chemistry: Surface Science and Electrochemistry”, Ed. K. Wandelt, Elsevier, Amsterdam, pp.403-421 (2018) [Review]

12) K. So, K. Sakai, K. Kano, Curr. Opin. Electrochem., 5,173 (2017) [Review]

13) H. Sakai, T. Nakagawa, H. Mita, H. Kumita, Y. Tokita, 217th Electrochemical Society Meet. Abstr. Electrochem. Soc.1001,396 (2010)

14) T. Miyake, S. Yoshino, T. Yamada, K. Hata, M. Nishizawa,J. Amer. Chem. Soc., 133, 5129 (2011)

15) K. So, S. Kawai, Y. Hamano, Y. Kitazumi, 0. Shirai, M. Hibi, J. Ogawa, K. Kano, Phys. Chem. Chem. Phys.,16, 4823 (2014)

16) K. So, Y. Kitazumi, 0. Shirai, K. Nishikawa, Y. Higuchi, K. Kano,J. Mater. Chem. A, 4, 8742 (2016)

17) H.-Q. Xia, K. So, Y. Kitazumi, O. Shirai, K. NishiKawa, Y. Higuchi,K.Kano,J.Power Sources,335,105(2016)A

18) K. Sakai, Y. Kitazumi, 0. Shirai, K. Takagi, K. Kano, ACS Catal.,7,5668(2017)

19) X.-X. Xiao, H.-Q. Xia, R. Wu, L. Bai, L. Yan, E. Magner, S. Serge, E. Lojou, Z. Zhu, A. Liu, Chem.Rev.,119,9509(2019) [Review]

20) Y. Kitazumi, K. Kano, “Electron-Based Bioscience and Biotechnology”, Eds. M. Ishii, S. Wakai, Springer, Chap. 7, in press (2020)

专栏：Fuel Cells in 2070 | 生物燃料电池