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摘要：本研究探讨了是否能够仅灭杀厌氧菌群中的产甲烷菌，开发由水解菌和产酸菌构成的产氢菌群。

关键字：消化污泥、厌氧消化、微生物、产氢、亲代菌群

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背景

活性污泥法是广泛使用的污水处理法，通过使好氧微生物摄取污水中的有机物来进行净化，因此会大量产生微生物的增殖生物质（剩余污泥）。一部分污水处理厂通过引入厌氧消化来减小剩余污泥的容积并利用生物质气提供热源。

厌氧消化过程包括3个阶段：将高分子有机物转化为低分子有机物的“水解阶段”；将低分子有机物分解为有机酸、氢和二氧化碳的“酸化阶段”；以及由乙酸、氢和二氧化碳制成甲烷的“甲烷化阶段”。

但是，即使进行厌氧消化，也只能分解剩余污泥中所含有机物的约40％，消化后产生难分解性残渣（消化污泥），并被焚烧处理。虽然已经报道了能够分解消化污泥的细菌和丝状菌，但由于细菌和丝状菌是好氧菌，因此虽然能够使用微生物的酶分解消化污泥，但无法产生生物质气。污泥的资源化需要“用于分解的好氧工艺”和“生产生物质气的厌氧工艺”这两个阶段。

最近，日本在东京的河流土壤中发现了能够由消化污泥直接生产甲烷的厌氧菌群（能够分解消化污泥并生产生物质气的菌群，以下，称为“亲代菌群”）。

另一方面，甲烷气体是天然气的主要成分，生产生物质气有助于节约化石燃料，但是甲烷气体也是一种温室效应气体。因此，氢作为继甲烷气体之后的新型可再生能源而备受关注。氢燃烧时不会产生温室气体，因此有望成为可减轻全球变暖的能源。因此，本研究探讨了是否能够仅灭杀上述菌群中的产甲烷菌，开发由水解菌和产酸菌构成的产氢菌群。

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实验方法

将亲代菌群（A和B两种）接种在装有消化污泥和纯水的瓶中，通过氮气置换使气相成为厌氧条件，进行4周培养。培养后，在30℃～121℃的温度下对菌液进行15分钟或30分钟的加热处理。将经加热处理后的菌液接种在装有消化污泥和纯水的瓶中，在氮气置换后的厌氧条件下进一步培养4周。培养后，通过气相色谱法分析顶部空间的气体成分。另外，对产氢菌群的纤维素酶、几丁质酶以及蛋白酶的酶活性进行测定。进一步提取出亲代菌群和产氢菌群的DNA，通过PCR-DGGE法分析细菌种类的变化。

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结果与分析

3.1 通过加热杀死甲烷菌

对加热处理后的亲代菌群进行培养，并用气相色谱仪分析气相（图1）。关于菌群A和B，均在30℃、50℃、60℃下加热处理后的样品中产生了甲烷，产甲烷菌未死亡。对菌群A进行80℃和100℃的加热处理，对菌群B进行80℃的加热处理后，不再产生甲烷，而是产生氢。需要说明的是，在121℃下对两种菌群进行加热处理时，均未产生甲烷和氢。对所得到的产氢菌群进行继代培养后发现，继代也能够产生氢气。

3.2 酶活性测定

在加热处理前的亲代菌群中，观察到水解酶对于消化污泥的主要成分——来自细胞壁的纤维素、甲壳素、蛋白质的活性，因此对产氢菌群是否保留有这些酶活性进行了试验（图2）。菌群A和B均保留有与亲代菌群同等程度的纤维素酶和几丁质酶活性，这表明亲代菌群中参与污泥的多糖分解的水解菌群中存在具有耐热性的属种。另一方面，来自亲代菌群A的产氢菌群的蛋白酶活性丧失，这表明亲代菌群中参与污泥的蛋白质成分分解的菌群中不存在具有耐热性的属种，已通过加热处理被杀死。因此，认为产氢菌群A通过分解纤维素、几丁质等糖质来产生氢。与此相对，来自亲代菌群B的产氢菌群的活性低于亲代菌群，但其残留有蛋白酶活性。由此可知，除了糖质以外，细菌类的细胞壁上存在的蛋白质也被用作产氢基质。

3.3 DNA分析

利用PCR-DGGE法对产氢菌群和亲代菌群的细菌种类进行了比较（图3）。分析结果表明，作为亲代菌群中主要菌种的几个属种在产氢菌群中并未检测到，其他非主要菌种在变为产氢菌群后成为主要菌种，由此可知进行加热处理后，细菌种类构成发生了变化。为推测亲缘关系，基于16S区域rRNA碱基序列制作了系统树（图4）。可知产氢菌群中存在Clostridiaceae、Oscillospiraceae和Pseudomonadaceae。

能够由消化污泥生产氢的菌群的开发