概要

日本京都大学的研究小组通过采用独特的细胞工程学方法，成功构建了一个可以从世界上最多的食品加工废弃物——豆类食品加工废弃物（比如豆腐渣等）中大量生产氨（氢的液体运输载体和新的无碳内燃燃料）的平台。

这一成果已于2021年8月24日在瑞士国际学术期刊《Sustainability》上在线发表。

1、背景

100多年来，通过哈伯-博施法在高温高压下生产氨，作为肥料原料，为地球上人类的发展做出了贡献，但是生产氨所用的能源占全世界能源消耗的1-2%，这也是导致全球变暖的原因之一。联合国宣布的SDGs（可持续发展目标）中包含了关于全球变暖和清洁能源等环境问题的宣言，这些问题都是由于消耗大量的化石燃料所引起的，也是导致气候变化的原因。因此，有必要建立一个使用生物燃料等代替能源的可持续发展社会。典型的生物燃料是生物乙醇，但氨作为下一代生物燃料也开始受到关注。以碳为原料的乙醇在燃烧后会产生二氧化碳。与之相比，由于氨在完全分解时只排放水和氮气，不会向环境排放温室气体，因此被认为是更加环保的无碳燃料。同时，如果生成氢的氨燃料电池得到了普及的话，氨将成为氢能的液体载体（图1）。

近年来，以发达国家为中心，大量的食品加工废弃物被排放，造成食品浪费等环境问题。例如，如果将世界上最多的食品加工废弃物——大豆残渣（表1）填埋在土壤中，由于环境中微生物的作用，会产生二氧化氮，对环境造成负担。因此，本研究旨在开发出一种从食品加工废弃物中生产氨，进而生产更加环保的生物燃料的有效方法。

图1 氢能社会

2、研究方法与成果

1.通过细胞表面工程学从细胞外的谷氨酰胺中生产氨

谷氨酰胺是一种对生物的生长很重要的氨基酸，为了从谷氨酰胺中生产氨，需要在细胞外将其转化为氨，以免影响细胞内的代谢。具有多种产业优势的酿酒酵母（Saccharomycess cerevisiae）具有很强的氨同化能力，如果直接敲除与氨同化相关的基因，将会对生物生长产生不利影响。因此，本研究中，首先通过在酵母细胞表面上呈递谷氨酰胺脱氨酶（一种从谷氨酰胺中生产氨的酶），从而高效地从谷氨酰胺中生产氨。

作为一种具有极强谷氨酰胺脱氨酶活性的酶，在大肠杆菌（Escherichia coli）寄居宿主大肠的过程中，为了通过中和来防止胃酸分解而生产的谷氨酰胺酶（YbaS）已经为人所知。为了在酵母细胞表面上呈递YbaS，通过融合α-凝集素（一种酵母细胞壁锚定蛋白，在YbaS的N端含有分泌信号，在C端含有GPI锚定附着信号序列）的基因，制备出了YbaS呈递酵母（图2）。当制备的YbaS呈递酵母与177mM谷氨酰胺水溶液发生反应时，氨的产率为83.2%。此外，用纤维素酶和蛋白酶对（此前几乎没有使用过的）实际的食品加工废弃物之一的“豆腐渣”进行预处理并进行反应，成功地从预处理过的“豆腐渣”中所含的谷氨酰胺中以高产量生产氨（图3）。

图2 能够从氨基酸中生产氨的细胞表层酵母

图3 从预处理过的豆腐渣的谷氨酰胺中生成氨

2. 通过L-氨基酸氧化酶从氨基酸混合溶液中生产氨

柱孢滑锈伞（Hebeloma cylindrosporum）是滑锈伞属的一种，可以有效地分解许多构成蛋白质的氨基酸从而生产氨。这是因为这种菌所产生的L-氨基酸氧化酶的底物特异性很低。利用这种低特异性，该菌能够分解土壤中的氮源——氨基酸，并摄取产生的氨，构成该菌独特的生存机制。然而，这种酶的利用并没有太大的进展。本研究中，采用细胞表面工程学的方法，将来源于嗜纤维菌（H.cellulovorans）的L-氨基酸氧化酶（HcLAAO）呈递在酵母细胞表面上，并用于从混合氨基酸溶液中生产氨。

已知L-氨基酸氧化酶通常需要FAD作为辅酶，因此研究了通过添加FAD从混合氨基酸溶液中生产氨的情况，结果发现HcLAAO呈递酵母在没有添加FAD的情况下，与添加了FAD的情况一样，也能够从氨基酸混合溶液中生产氨。由于已有报告表明FAD可能会与氨基酸氧化酶形成共价键，因此暗示了本研究中所用的HcLAAO也可能在细胞内与FAD发生共价结合。

在研究了HcLAAO的表达条件后，尝试在最佳条件下从氨基酸混合溶液中生产氨。结果，从20mM的氨基酸混合溶液中生产出12.6mM的氨，为理论产率的63.0%。这证实了HcLAAO可以从氨基酸混合溶液中高效地生产氨，因此紧接着使用预处理过的“豆腐渣”悬浮液进行了氨的生产。结果显示，与使用YbaS呈递酵母相比，每1g的“豆腐渣”成功生产了3倍以上浓度的氨（图4）。从这个结果来看，通过呈递给细胞的HcLAAO，能够从食品加工废弃物的氨基酸中高效地生产氨，同时还成功构建了一个具有高附加值的α-酮酸的生产系统。

图4 从预处理过的豆腐渣中生成氨

3、研究意义

从保护地球环境的观点来看，食品加工废弃物的利用和再循环是最理想的。另一方面，使用固氮酶等酶，从空气中的氮气中固定氨同样是理想的方法，但由于固氮酶对氧气非常敏感，因此不能在有氧条件下使用。随着这种酶在有氧条件下也能起作用的微生物的发现，未来，这种氨的无碳生产方法有望取代环境负荷大的哈伯-博施法，成为一种环保且有前景的生物生产技术。

由食品加工废弃物制造氨的生物生产平台！通过生物技术为构建脱碳社会作贡献